Криохранилище для лаборатории нейрофиброматозов

Нейрофиброматозы - это несколько типов редких наследственных заболеваний, которые проявляются уже в раннем детстве развитием множественных опухолей нервной системы.

В нашей стране детям, страдающим нейрофиброматозами, не только не предоставляется лечение, но часто даже не ставится правильный диагноз. Врачи лишены исследовательской поддержки, поскольку у нас нет лабораторий, изучающих эти заболевания, а у пациентов нет шансов попасть в клинические исследования новых препаратов (о «старых» препаратах вообще речи не идет, так как лечение все еще находится в стадии разработки).

Для нейрофиброматоза 1-го типа (НФI) характерно появление на коже пятен цвета «кофе с молоком» и веснушек, располагающихся в необычных местах, сколиозов и других изменений скелета, множественных опухолей на коже и периферических нервах, опухолей зрительного нерва, а у каждого десятого пациента развиваются быстро метастазирующие злокачественные опухоли периферических нервов, не поддающиеся лечению, что неизбежно приводит к скорой смерти.

Нейрофиброматоз 2-го типа (НФII) встречается реже, но протекает еще тяжелее. Это заболевание сопровождается появлением опухолей внутри черепа и спинномозгового канала. Лишь десятки из сотен тысяч пациентов (0,01%) доживают до 30 лет, и единицы - до 50.

К сожалению, эффективного лечения нейрофиброматозов пока нет, и в течение жизни пациенты вынуждены подвергаться многократным операциям по удалению опухолей, что все равно приводит к инвалидности.

Проблема поиска лекарств от нейрофиброматозов в том, что нет хороших моделей для исследования.

Изучение путей развития заболеваний, как и поиск лекарств, начинается с исследований in vitro - на клетках, моделирующих заболевание, и in vivo - на животных, у которых удалось вызвать это заболевание. Учёные изощряются как могут - создают генномодифицированных животных (но животные болеют не так, как люди. Как правило, у них НФ протекает гораздо легче), пытаются выключать гены NF1 или NF2 в эмбриональных фибробластах или в шванновских клетках - но эмбриональные или шванновские клетки можно получить, опять же, только у животных (по этическим соображениям), то есть, и такие варианты далеки от идеала. Хорошей моделью являются, например, клетки, полученные непосредственно из удалённой у пациента опухоли. Их можно сделать бессмертными, размножить и распространить по лабораториям, занимающимся исследованиями нейрофиброматозов.

Мы разработали совместный проект нашей лаборатории, Центра Бурденко, МГНЦ, МФТИ и Межрегиональной общественной организацией содействия и помощи пациентам с нейрофиброматозом «22/17» - по выделению клеток из опухолевого материала пациентов и превращению этих клеток в бессмертные линии. Мы хотим полностью охарактеризовать эти клетки: уточнить, какая мутация имеется в основном гене, определяющем заболевание, какие сопутствующие мутации делают эту опухоль более или менее агрессивной, насколько активны в клетках опухоли сигнальные белки, отвечающие за скорость деления и подвижность этих клеток, насколько обмен веществ в опухолевых клетках отличается от нормального. Такая всесторонняя характеристика этих клеток позволит разработать персонализированный подход к лечению пациентов. Если у нас всё получится, мы планируем предоставить эти модели в Фонд детских опухолей (Children's Tumor Foundation), откуда их могли бы получить учёные со всего света и использовать для исследования действия лекарств, а также, для уточнения особенностей патогенеза нейрофиброматозов.

У нашей лаборатории много потребностей, но самая острая сейчас - это организация жидкоазотного хранилища клеток.

В нашей лаборатории собрана большая коллекция клеточных линий, моделирующих различные раковые заболевания и, главное, несколько уже созданных клеточных линий, моделирующих нейрофиброматозы I и II типа. Сейчас запас клеток в замороженном виде хранится в морозильнике на -80о С. Это само по себе не очень хорошо для клеток: длительно хранить замороженные культуры необходимо при гораздо более низких температурах – в дьюарах с жидким азотом. Впрочем, спасибо институту, что нам выделили деньги на этот морозильник - ведь раньше клетки приходилось хранить по договорённости в другом институте, на Варшавском шоссе, и каждая заморозка - разморозка превращалась в целый квест с заездом за сухим льдом, транспортировкой льда в лабораторию, а потом клеток на льду на Варшавку. Теперь клетки всегда под рукой... Но представьте, что они хранятся в морозильнике, питающемся от сети, а электричество вдруг отключают на 6 часов без предупреждения (а именно это и произошло несколько месяцев назад)!

Сосуд Дьюара не самого раскрученного бренда, но достаточного объёма стоит 450 - 700 тыс. рублей, дозаправка его азотом обходится примерно в 1000 р. в месяц – небольшие деньги, но весомые, если выкладывать их из собственного кармана. Тем более, что ещё изрядную сумму съест первичная заправка его азотом, а также, необходимо приобрести систему для погружения и хранения клеток в азоте - рэки и криобоксы.

Вот такой он - сосуд нашей мечты:

Вы можете рассказать об этом проекте друзьям и знакомым. Если вы - коллега-исследователь, то можете связаться с нами и поучаствовать в совместном проекте. Если вы - врач, у которого есть пациенты с нейрофиброматозом, или тот самый пациент - то вы тем более можете связаться с нами, и мы разработаем план взаимовыгодного сотрудничества.

Но самое главное - вы можете поддержать нас финансово! Мы будем благодарны за любую сумму, ведь потребностей у лаборатории очень много!

Наш проект не предполагает производства коммерческого продукта. Мы даже не можем пообещать, что сию секунду сделаем эффективное лекарство (но мы прилагаем все усилия, чтобы такое лекарство появилось в будущем). Но в благодарность за вашу поддержку мы сделали много разных приятных сувениров и подготовили увлекательные путешествия в лабораторию. Честное слово, мы вложили душу в эти маленькие свидетельства нашей благодарности!

Мы не можем предложить вам красиво изданную книгу или эксклюзивный диск с фильмом, но можем подарить наше главное вознаграждение - сознание того, что, благодаря вашей поддержке, дети получат шанс прожить дольше. С вашей помощью мы можем получить качественные практические результаты и победить нейрофиброматоз.

Мы - одна из немногих, если не единственная лаборатория в России, занимающаяся исследованиями и поиском лекарств от фатальных детских заболеваний - нейрофиброматозов.

Мы - команда молодых учёных, которые хотят помочь тысячам детей с этим диагнозом и готовы работать, не взирая на трудности, на энтузиазме и вере в победу.

Мы - Группа нейрофиброматозов Научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии РНИМУ им. Пирогова.

В наших исследованиях мы сотрудничаем с Лабораторией волновых процессов МФТИ https://mipt.ru/science/labs/wave_processes_and_controlling_systems_lab/,

Национальным медицинским исследовательским центра нейрохирургии имени академика Н. Н. Бурденко https://www.nsi.ru/,

Медико-генетическим научным центром имени академика Н.П. Бочкова https://med-gen.ru/,

лабораторией Джонатана Чернова в Фокс-Чейзовском онкологическом центре в Филадельфии https://www.foxchase.org/jonathan-chernoff

и лабораторией Оливера Ханеманна в Университете Плимута https://www.plymouth.ac.uk/staff/oliver-hanemann

О НАС

Во всём мире лишь несколько десятков лабораторий занимаются исследованиями нейрофиброматозов, а наша - первая и единственная в России. Я организовала Группу нейрофиброматозов на базе НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова, и теперь здесь под моим руководством работает молодая команда из студентов старших курсов и аспирантов, твердо настроенная решить проблему нейрофиброматозов.

Меня зовут Дина Сергеевна Степанова, я фармаколог, а исследованиями нейрофиброматозов занялась в США, где работала с 2006 по 2013 г. В Штатах я проходила стажировку в Фокс-чейзовском онкологическом центре в Филадельфии, и нейрофиброматоз II типа был темой моей дипломной работы, а затем и диссертации. За 7 лет работы в Америке мне удалось значительно продвинуться в исследованиях, я описала вызванные НФII изменения обмена веществ в клетках опухолей. По результатам исследований опубликованы статьи в авторитетных международных научных журналах и сделаны доклады на нескольких конференциях.

Наши статьи:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5600854/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6049319/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5405558/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608634/

Вернувшись в Россию и защитив диссертацию в родном университете (бывшем Втором Меде), я стала искать возможность продолжить работу здесь, именно потому, что у нас в стране практически никто не занимается этими заболеваниями. На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии нашлись помещения и кое-какое оборудование, оставшееся от упразднённой кафедры физики. Постепенно сформировалась наша команда – кто-то пришёл дипломником, кто-то практикантом, кто-то аспирантом. Все мы хотим переломить ситуацию с нейрофиброматозами не только в России, но и во всем мире. Мы продолжаем изучать механизм развития нейрофиброматозов I и II типа, сходства и различия, чтобы использовать их при дальнейшей разработке направленного и индивидуального лечения.

За последние несколько лет мы значительно продвинулись в изучении нейрофиброматоза. После докладов на конференциях по нейрофиброматозу результаты наших работ взяты на вооружение коллегами-исследователями в разных странах. Мы близки к тому, чтобы предложить три лекарственных препарата для профилактики развития опухолей.

О ТОМ, КАК СОЗДАВАЛАСЬ ЛАБОРАТОРИЯ

Точнее было бы сказать "как лаборатория собиралась по крупицам". Буквально несколько лет назад в нашей лаборатории был лишь прибор для RT-ПЦР, имеющийся почти в любой лаборатории, и учебный культуральный блок.

Вот так они выглядели: блок ПЦР (слева) и старая культуральная (справа)

Но мы не унывали и начали обустраивать то, что было. Сначала мы купили многоканальный фотометр и оборудование для иммуноферментного анализа.

Потом произошло в целом печальное событие, однако для нас оно обернулось радостью: на нашем Медико-биологическом факультете расформировали кафедру физики, и институт отдал нам часть их помещений. Выглядело это так:

Но в глубине этих катакомб обнаружилось чудо - настоящий оборудованный на современном уровне культуральный блок - стерильные изолированные комнаты для выращивания клеток млекопитающих!

Затем мы обнаружили ещё одну неиспользуемую комнату по соседству. О, это была эпопея! В бывшей учебной комнате на некоторое время поселились рабочие, выполнявшие косметический ремонт в здании. Потом ремонт закончился, рабочие ушли... А комната осталась. Со следами пребывания рабочих. И прежде, чем заселяться, мы вынуждены были сделать ремонт уже в этой комнате. Своими силами, разумеется. Теперь мы специалисты в заливке полов и укладке линолеума!

Зато получили отдельное помещение, которое используем для иммунологических и молекулярно-биологических методов, не требующих стерильности, но зачастую предполагающих использование пахучих и агрессивных веществ. Впечатлившись нашим героизмом, университет купил нам новое оборудование - автоматический счётчик клеток и источник тока и камеры для электрофореза белков.

Вот так мы выглядим сейчас:

Далее в закромах обнаружился старый, но работающий флуоресцентный микроскоп - с единственным зелёным фильтром и жутко тормозной и шумной камерой. Конечно, мы мечтаем о новом инвертированном флуоресцентнике с несколькими каналами и хорошей камерой, но пока посредством нескольких переходников и мобильного телефона ухитряемся получать приличные изображения и при помощи нашего старичка.

Но для эффективной качественной работы нам не хватает прочих приборов и материалов, которые существенно сэкономят наше время, а также обеспечат наилучшее качество и воспроизводимость результатов экспериментов.

О ЧЁМ МЫ МЕЧТАЕМ

Мы хотим, чтобы наша лаборатория соответствовала современным требованиям к проведению научных исследований. Чтобы нам не приходилось изобретать способы поставить эксперимент, и наши силы были направлены на поиск лечения от нейрофиброматоза, а не на поиск подручных средств для выполнения исследования.

ЧЕГО НАМ ДЛЯ ЭТОГО НЕ ХВАТАЕТ

Помимо дорогого оборудования лаборатории необходимы для «повседневной жизни» различные расходные материалы: культуральные среды, реактивы, пластик и многое другое. В среднем в месяц расходуется около 200 тысяч рублей. Сумма кажется огромной, но достаточно тысяче человек скинуться буквально по 200 рублей - и лаборатория сможет без проблем функционировать целый месяц! Но если расходные материалы мы еще (хоть и не без труда) можем заказать через институт, поскольку наши исследования являются госзаданием, то с оборудованием ситуация катастрофическая. По этой статье деньги нам не выделяются. Сейчас лаборатория остро нуждается в инвертированном флуоресцентном микроскопе, который стоит минимум 2 млн рублей. Ужасно нужны 3 комплекта автоматических пипеток - около 30 тыс рублей каждый. Концентрацию ДНК мы измеряем на громоздком и совсем не приспособленном для наших задач УФ-фотометре 1980-ого года рождения, поэтому на одно измерение уходит изрядный объём образца и полчаса времени... Современный прибор, использующий в 100 раз меньшие объёмы и уже готовую программу измерения стоит около миллиона рублей, а его более простой брат, тоже с программой, но с чуть большим объёмом образца - 200 тыс. р. Мы так активно развиваемся и расширяемся, что уже почти перестали помещаться в нынешнем культуральном блоке, назрела покупка нового СО2-инкубатора за 400 тыс рублей и ламинарного шкафа за 300 тыс рублей. Бактерии выращиваются и вовсе на самодельном аппарате, и только в маленьких объемах. Нормальный термостатируемый орбитальный шейкер стоит порядка 300 тыс рублей.

Мы постоянно ищем источники финансирования: подаем на гранты, привлекаем спонсоров, уговариваем начальство, проводим обучающие курсы. Серьезная наука - это очень дорого, но результаты исследований бесценны, а спасённые жизни не измеряются финансами.

Именно поэтому мы так надеемся на вас!

• Eсли мы соберём 300 тысяч, то не сможем купить дьюар, но зато приобретём расходные материалы, которых хватит на месяц работы, и индивидуальные комплекты автоматических пипеток для каждого вида работ, что практически жизненно необходимо - ведь человеческие клетки не терпят попадания в культуру бактерий, а препараты ДНК не терпят попадания вообще ничего постороннего. Если же на все работы одна пипетка, то загрязнения неизбежны даже при самой педантичной технике.
• Если мы соберём целевую сумму, мы приобретём сосуд Дьюара на 100 л, рэки и криобоксы для погружения и хранения клеток и криоперчатки, а также, оплатим запас азота на несколько месяцев. Собранные сверх целевой суммы средства будут потрачены на повседневные нужды лаборатории.
• Если мы соберём 900 тысяч, мы не только организуем жидкоазотное хранилище для клеток, но и обустроим систему хранения и распределения углекислого газа - ведь сейчас тяжеленные (80 кг) и ГРЯЗНЫЕ баллоны мы не только заказываем за свой счёт, но и таскаем на собственных плечах на три этажа вверх, а ставить этих чудовищ приходится, тщательно оттерев спиртом, прямо в культуральный блок.
• Если мы соберём 1 миллион 200 тысяч, то сделаем систему распределения газа, криохранилище и приобретём отдельный ламинар-бокс для работы с бактериями.
• Если мы соберём 1 миллион 800 тысяч, то для работы с бактериями будет организовано отдельное помещение, как и должно быть в нормальной научной лаборатории.
• Ну а если вдруг наберётся больше 3 миллионов - то мы сможем позволить себе новый флуоресцентный микроскоп.